Application of flow cytometry analysis to elucidate the impact of scale-down conditions in Escherichia coli cultivations

Abstract

In homogeneities appear in large-scale fed-batch bioprocesses; especially when the distribution of the feeding solution and of the oxygen is uneven. In order to study the consequences of these heterogenic conditions on the culture, scale-down bioreactor experiments have been designed. These studies have revealed that cells exposed to oscillatory conditions are affected on various cellular levels of regulation. However, not many of these studies have been performed on the observation of the behaviour of the single cell level of Escherichia coli. Therefore, flow cytometry (FCM) is chosen as analytical tool to study the cellular viability in the scale-down approaches of a two compartment reactor (Two-CR) and a newly established three compartment reactor (Three-CR). An optimization of different staining methods applied in these experiments is also performed, since staining procedures for flow cytometry studies of bacterial populations are still not well-established yet.

En bioprocesos de escala industrial aparecen gradientes; especialmente cuando no se alcanza una distribución homogénea ni de la alimentación ni del oxígeno. Para estudiar las consecuencias de estas condiciones heterogéneas sobre el cultivo, se han diseñado experimentos que imitan las condiciones de gran escala en el laboratorio (experimentos de scale-down). Estos estudios han puesto de manifiesto que las células expuestas a condiciones oscilatorias se ven afectadas en varios niveles celulares de regulación. No obstante, se han realizado pocas investigaciones en base a la observación del comportamiento de Escherichia coli a nivel unicelular. Por este motivo, fue la citometría de flujo (FCM) la técnica elegida para estudiar la viabilidad celular en experimentos de scale-down. Estos se llevaron a cabo en sistemas comparimentados de dos compartimentos (Two-CR), así como en el recién establecido de tres compartimentos (Three-CR). Debido a que los métodos de tinción de la citometría de flujo para la aplicación en bacterias aún no están establecidos, fue necesaria su optimización para ser utilizados en estos experimentos.

En bioprocessos d’escala industrial apareixen gradients; especialment quan no s’assoleix una distribució homogènia ni de l’alimentació ni de l’oxigen. Per a estudiar les conseqüències d’aquestes condicions heterogènies sobre el cultiu, s’han dissenyat experiments que imiten les condicions de gran escala al laboratori (scale-down experiments). Aquests estudis han posat de manifest que les cèl·lules exposades a condicions oscil·latòries es veuen afectades a diversos nivells cel·lulars de regulació. No obstant, s’han dut a terme poques investigacions en base a l’observació del comportament d’ Escherichia coli a nivell unicel·lular. Per aquest motiu, fou la citometria de flux (FCM) la tècnica escollida per a estudiar la viabilitat cel•lular en experiments de scale down. Aquests es duren a terme en sistemes comparimentats de dos compartiments (Two-CR), així com en el recentment establert de tres compartiments (Three-CR). Degut a que els mètodes de tinció de la citometria de flux per a l’aplicació en bateries encara no estan establerts, fou necessària la seva optimització per a ser utilitzats en aquests experiments.